L’avanzamento scientifico e tecnologico in ambito genetico ha aperto le porte a nuove frontiere per l’interpretazione del genoma umano, anche a scopo forense. Le linee guida nazionali e internazionali si avvalgono dello studio di alcuni polimorfismi presenti nel DNA al fine di tracciare un profilo genetico unico per ogni individuo.

Ad oggi la genetica forense è uno dei più importanti settori dell’identificazione individuale. Inoltre, il progresso delle conoscenze scientifiche nel campo della biologia molecolare ha reso possibile il passaggio dall’identificazione personale all’analisi fenotipica dei caratteri visibili esternamente (EVC) e ne ha, negli ultimi decenni, determinato un rapido sviluppo.

All’interno del genoma umano vi sono delle sequenze di DNA altamente ripetute ipervariabili (STR

– Short Tandem Repeats). Gli STR nello specifico sono polimorfismi correlati alla lunghezza e legati al numero variabile di nucleotidi presenti nei diversi alleli. Tali loci sono stati definiti microsatelliti o Short Tandem Repeat in relazione alle piccole dimensioni della sequenza di base e presentano unità di ripetizione comprese tra le due e le sette paia di basi, con lunghezza massima di circa 350 paia di basi. Inoltre, le STR necessitano di un tasso mutazione estremamente contenuto (0.001-0,002%). Ad oggi vi sono migliaia di loci STR utilizzati per la mappatura del genoma umano e sono frequentemente utilizzati nelle indagini forensi.

Le prime analisi sulla variabilità (polimorfismi) di queste regioni del DNA sono state effettuate mediante Southern blot. Tale tecnica consiste nella ibridazione di frammenti genomici con sonde radioattive. Tuttavia, questo test non poteva essere eseguito su esigue tracce biologiche degradate poiché richiedeva notevoli quantità di DNA.

Successivamente, l’avvento della PCR (Polymerase Chain Reaction), ha consentito di effettuare le analisi genetiche su quantità molto piccole di sostanza biologica, dando così inizio allo sviluppo della genetica forense così come la conosciamo oggi.

Pertanto, negli ultimi anni la genetica molecolare ha assunto il ruolo di vera e propria scienza forense diventando uno strumento indispensabile per la risoluzione di casi giudiziari.

La genetica forense è diventata fondamentale in ambito sia civile che penale, rispettivamente per la verifica di rapporti di parentela, il riconoscimento di tracce di DNA all’interno di una scena del crimine e l’identificazione di soggetti coinvolti in incidenti e stragi.

Negli ultimi anni il nostro laboratorio è stato coinvolto in differenti casi di cronaca locale come, ad esempio, riconoscimenti di vittime di incidenti violenti, quali incendi o esplosioni, che ne hanno reso difficile l’identificazione. Il laboratorio ha acquisito una elevata expertise nell’analisi di materiale genetico da resti umani grazie all’ottimizzazione delle tecniche di estrazione di DNA (manuale e semiautomatizzata).

Le scienze forensi trovano applicazione anche nelle metodologie archeologiche quali ad esempio ricognizione, rilevamento, archiviazione e classificazione dei reperti. L’archeologia forense, quindi, va ad unire le metodiche archeologiche ed il contesto scientifico forense. Pertanto, risulta chiaro come essa possa essere utilizzata nella conservazione di beni culturali di valenza sia storica che religiosa.

Ciò permetterebbe di indagare sull’origine di alcuni eventi inspiegabili, come ad esempio quelli nell’ambito religioso. A tal proposito il nostro laboratorio ha partecipato all’analisi di alcuni reperti storici e religiosi. Le nuove tecnologie utilizzate hanno permesso di svolgere accertamenti sull’eventuale presenza di tracce di origine umana e l’eventuale profilo genetico su una serie di campioni, prelevati da diversi oggetti, tra cui crocifissi, immagini sacre e statue.

In particolare, una delle ultime analisi è stata effettuata sul campione di presunte lacrime prelevato da una Statua della Madonna.

A tale scopo, sono state effettuate le seguenti analisi:

1. Analisi Protemica shotgun per la caratterizzazione del contenuto proteico mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa tandem (nanoLC-Orbitrap- MS/MS), tramite nano-UPLC Ultimate 3000 accoppiato a Orbitrap
2. Estrazione del DNA da spot, su vetrino, contenenti il campione preso in Genotipizzazione del DNA estratto attraverso il sistema di amplificazione NGM Detect, Applied Biosystems;
3. Analisi del profilo genetico ottenuto tramite software

L’analisi del contenuto proteico, dopo ricerca nel database Human ha messo in luce 79 proteine con un FDR (False Discovery Rate) < 1.00 %, alcune generalmente molto abbondanti nel sangue e alcune generalmente più abbondanti delle lacrime. L’FDR è un valore percentuale che esprime la probabilità dei falsi positivi nella lista delle possibili identificazioni. È opportuno rapportarsi ad un valore basso di FDR (inferiore ad 1).

Sono stati identificate proteine come il Lisozima C (LYSC_HUMAN), la Lattoferrina (o Lattotransferrina) (LTF_HUMAN) e la Proteina inducibile da prolattina (PIP_HUMAN), abbondanti

nel fluido lacrimale con elevato iBAQ nei campioni incogniti rispetto al BLK. Inoltre, sono state individuate altre proteine abbondanti nel sangue come Albumina, Complement C3, Serotransferrina e Emoglobina. L’ Emoglobina è stata identificata nel campione incognito in tutte le sue isoforme con score superiore a 300 ed in particolare sono state messe in luce le subunità alpha, beta, delta e gamma- 2 (HBA, HBB, HBD, HBG2_HUMAN), in ordine di coverage crescente (HBA – 94.1%, HBB – 93.6%, HBD – 86.4%, HBG2 – 42.2%). Nessuna isoforma di Hb è stata identificata nel campione di controllo.

Le analisi del DNA hanno permesso di ottenere un profilo genetico quasi completo (12 alleli rilevabili su 17) esclusivamente sui campioni di DNA prelevati dalla Statua della Madonna. In conclusione, le analisi effettuate hanno dimostrato nel campione analizzato la presenza di lisozima ed emoglobina umana, suggerendo una composizione a base di lacrime e sangue. La genotipizzazione del campione ha permesso di ottenere un profilo genetico umano di sesso femminile. Pertanto, in assenza di un profilo genetico di riferimento non è possibile stabilire l’identità del soggetto a cui il campione biologico appartiene.

Prospettive future

L’incremento delle conoscenze nell’ambito genetico ed anche tecnologico va a segnare per le scienze forensi la possibilità di accedere a nuove informazioni riguardanti il genoma umano. Studi recenti sulle popolazioni hanno portato alla scoperta di informazioni utilizzate per sviluppare nuove tipologie di test come il sistema HIrisPlex. Tale sistema ha lo scopo di comprendere e prevedere le caratteristiche visibili esternamente (EVC) come il colore degli occhi, dei capelli e della pelle dal DNA estratto. Le informazioni ottenute nel campo della biologia forense sono molto apprezzate, poiché l’analisi del DNA ha un elevato potere discriminante. Questo potrebbe anche essere un valido strumento per aiutare nell’identificazione di resti umani, o per la profilazione e lo studio di reperti archeologici storico-religioso.

______________________________________________________________

Prof. Liborio Stuppia – Dott.ssa Rossella Ferrante

          Hanno collaborato:

                   – Dott.ssa Michela Cicirelli

                   – Dott.ssa Erika Palumbo

                   – Dott.ssa Carlotta Buccolini

                   – Dott. Alex Zappacosta